肌萎缩侧索硬化（amyotrophiclateralsclerosis，ALS）是一种致死性的神经变性疾病，病因不详，进展迅速，以上、下运动神经元损害的症状和体征为主要临床表现，如肌肉萎缩、无力、锥体束征，等。病情进展最终导致患者因吞咽障碍或呼吸衰竭而死亡。除上述运动症状之外，ALS患者还可能存在认知损害、疲乏、疼痛、抑郁等非运动症状。研究发现ALS患者从症状出现至死亡的中位生存期为2-3年。目前，ALS缺乏有效治疗手段，仅有利鲁唑及依拉达奉两种药物被证实能短暂缓解病情进展，却无法改变患者的最终结局。近年来，关于ALS发病机制的研究取得了巨大进展，不仅发现SOD1、C9orf72、TARDBP、FUS等20多种可能导致大多数家族性和少数散发性ALS的基因突变，而且肠道菌群紊乱等环境因素或环境与遗传共同因素对ALS的作用也逐渐被察觉。随着高通量检测技术的发展，检测肠道菌群组成取得显著进展，ALS与肠道菌群的相关性研究也逐步从描述菌群的组分分析开始向菌落失调与ALS疾病因果关系的研究转变。
01
ALS的肠道菌群特征
尽管健康的肠道菌群的相对组成与分布因个体而异，且受个体遗传基因及饮食等各种环境暴露因素的影响，健康的肠道菌群却仍具有较高且恒定的类群多样性、基因丰度和稳定的菌群核心功能。但是，有研究结果提示，ALS动物模型和患者的肠道菌群，其组分及功能存在紊乱及异常。
动物实验研究中，通过16SrRNA测序检测SOD1G93AALS模型小鼠粪便的细菌谱，发现与野生型比较，ALS模型小鼠肠道中产丁酸细菌（主要为溶纤维丁酸菌）、大肠埃希菌、厚壁菌及链球菌减少，并伴随着菌群种类的降低。另外，Huang等研究发现SOD1G93AALS模型小鼠存在昼夜节律紊乱，且在小鼠起病后不久肠道蓝藻菌的丰度升高，而昼夜节律紊乱又进一步增加了蓝藻菌的丰度。
一项临床研究中，对4例ALS患者的粪便标本进行肠道菌群检测分析，结果发现与健康对照者比较，ALS患者粪便中厚壁菌门/拟杆菌门和瘤胃球菌的丰度降低，并且存在肠道炎症表现。此外，另有研究也得出了类似结果，发现相较于健康者，ALS患者的肠道细菌和古细菌群落的丰度和均匀度更差，且厚壁菌门/拟杆菌门、甲烷还原菌的相对丰度有所降低，有益微生物（粪杆菌属和拟杆菌属）的相对丰度也呈下降趋势。Mazzini等研究同样发现ALS患者大便标本的DNA浓度较低，梭状芽孢杆菌和酵母菌丰度下降，而大肠埃希菌等肠杆菌丰度增加。近年，DiGioia等一项纳入了50例ALS患者，探究通过口服益生菌影响肠道菌群和ALS疾病进展的干预性研究中，将50例ALS患者随机分成A、B两组，A组分别口服安慰剂3个月及益生菌制剂3个月，B组口服益生菌制剂6个月。在6个月干预期后结果发现，B组拟杆菌属中的理研菌科比例较A组显著增加。
以色列魏茨曼科学研究所Eran团队在功能性分析研究中，发现SOD1转基因（Sod1-Tg）ALS小鼠模型运动症状出现前就已存在肠道菌群失调，给予广谱抗生素饲养的Sod1-Tg小鼠组，肠道微生物群减少后，小鼠的运动症状恶化程度显著高于安慰剂组。该团队进一步鉴定出11种细菌可能与ALS有关，分别将这11种单菌植入至预先给予抗生素饲养的Sod1-Tg小鼠和野生型小鼠肠道中，结果发现植入狄氏副拟杆菌和扭链瘤胃球菌加速了Sod1-Tg小鼠的ALS病程进展，乳酸杆菌和产黑普雷沃菌干预也促使Sod1-Tg小鼠的ALS运动症状恶化。然而，这11种菌株并未影响野生型小鼠的运动功能。
尽管大多数对ALS动物模型及患者的肠道菌群分析都得出了相似的结果，但也存在部分研究所得的结果有所不同。Brenner等对25例ALS患者和32例年龄性别相匹配健康人的粪便微生物群采用16SrRNA高通量测序分析，结果发现两者在细菌类群的多样性、丰度以及宏基因组软件预测的肠道菌群基因组DNA总和差异无显著性。Ngo等比较研究了49例ALS患者和51例健康对照者的粪便微生物组的组成及多样性，发现ALS患者与健康对照者肠道菌群的组成差异无显著性，但壁厚菌门/拟杆菌门菌比值较大的ALS患者生存期更短。
综上，不同研究项目结果存在一定出入，其可能原因包括：研究人群的种族差异、生活及饮食习惯不同、以及不同研究所纳入的ALS患者临床分期差异较大。总体而言，研究表明ALS患者的肠道菌群组成成分有着相对的特征改变：①ALS患者肠道细菌的相对丰度、群落结构明显失衡；②衡量肠道菌群健康状况的重要指标为厚壁菌门/拟杆菌门比值，在现有的ALS患者研究中均显示出异常。可见肠道菌群在一定程度上对ALS的发生和进展有着不容忽视的作用。
02
微生物-肠-脑轴与ALS
越来越多的证据表明，生理和病理条件下，肠道菌群主要通过微生物-肠-脑轴（microbiota-gut-brainaxis，MGB）的双向途径影响人类行为和大脑功能。MGB主要涉及肠道菌群、肠神经系统、中枢神经系统、交感神经和副交感神经系统、神经内分泌和体液途径、细胞因子和神经肽等信号分子。表明大脑可以通过中枢神经系统调节肠道菌群的组成和功能，同时肠道菌群又可以通过内分泌系统、免疫系统、代谢系统和神经内分泌等多种途径影响中枢神经系统。以下探讨近年来相关肠道菌群直接或间接影响ALS的可能机制。
2.1肠道菌群失调可增加肠壁通透性
目前研究提示微生物群可能是通过调节内脏神经递质和细菌代谢物影响血脑屏障，然而其确切机制尚不完全清楚。正常情况下，肠壁的完整性限制了病原微生物进入肠道组织和循环系统，此限制作用主要来自于黏液和相互连接的上皮细胞。然而，肠道细菌产生的某些信号可以影响肠壁的完整性、肠道功能和肠道的节段运动。大量相关研究数据揭示了肠道菌群可调节构建肠道紧密连接所需蛋白的表达和分布，并激活肿瘤坏死因子（tumornecrosisfactor，TNF）、白细胞介素（interleukin，IL）-1β和IL-6等细胞因子，这些因子又可作用于肠道紧密连接蛋白导致肠壁通透性增加。从而使许多神经*性分泌物甚至病原微生物进入循环，再通过血脑屏障进入中枢神经系统，触发神经系统乃至全身的炎症反应。Wu等对2月龄的SOD1G93AALS模型小鼠的肠壁组织进行Westernblot分析，发现SOD1G93AALS模型小鼠在症状出现前，肠道中紧密连接相关的ZO-1蛋白表达显著降低，并且出现分布异常，钙黏蛋白表达也有所降低。
2.2ALS免疫及炎症机制
神经炎症是包括ALS在内的多种神经变性疾病的常见病理特征，可表现为中枢神经小胶质细胞和星形胶质细胞活化，以及外周血淋巴细胞和巨噬细胞表达上调。大量研究提示，ALS致病基因（如SOD1、TARDBP和C9orf72）与神经炎症相关。但除遗传因素外，肠道菌群失调也可改变机体的免疫及炎症状态，并通过肠-脑轴促进ALS的发生发展。越来越多的证据表明，肠道菌群可以影响调节性T细胞（Treg）表达水平参与ALS疾病进展。ALS疾病进展的过程中，小胶质细胞从M2表型（神经保护作用）转变为M1表型（神经*性作用），而M1/M2小胶质细胞的表型转换与Treg数量相关。研究发现ALS患者中Treg数量和Treg%均下降，并且ALS患者的Treg数量下降与疾病进展和严重程度相关。Mandrioli等进行了一项多中心随机对照双盲试验研究，在试验开始和进行至6个月时，将健康捐赠者的新鲜粪便稀释液注入28例试验组ALS患者的肠道内，即肠道菌群移植（fecalmicrobialtransplantation，FMT）治疗，另14例对照组ALS患者未接受FMT治疗。于基线、6个月和12个月时对两组患者进行肠道内镜活检，结果显示与对照组比较，试验组Treg数量从基线开始至第6个月时显著增加。
另外，针对ALS小鼠模型的研究直接提示肠道菌群可改变机体的炎症状态，从而影响ALS的起病和疾病进展。研究表明环境因素可能是C9orf72突变小鼠生存时间的一个重要调节器。Burberry等，分别对饲养于博德研究所（BroadInstitute）和哈佛生物研究基地（HarvardBiologicalResearchInfrastructure）的C9orf72敲低、敲除和野生型小鼠进行研究，结果发现饲养于哈佛的C9orf72敲除小鼠相对饲养于博德的同种基因型小鼠更早死亡。为了证实肠道菌群是否对结果产生了影响，其对同样饲养于哈佛的C9orf72野生型和基因敲除小鼠分别用广谱抗生素及安慰剂进行饲养，结果显示应用抗生素组显著降低了C9orf72敲除小鼠的炎症和自身免疫等相关表型，表明当C9orf72表达减弱时，肠道菌群紊乱可促进炎症和自身免疫反应。该团队进一步对C9orf72敲除小鼠进行FMT，发现移植健康肠道菌群可显著改善小鼠炎症。可见肠道菌群对ALS存在着双重作用，健康肠道菌群中存在某种信号可降低患者肠道的炎症及自身免疫反应，不过一旦菌群失调就有可能加重机体的炎症反应。
2.3生物化合物与ALS
肠道菌群集中的部位与ALS的病变部位相距甚远，其除了可以影响机体免疫以外，还可通过对存在于体循环内的代谢物进行调控甚至产生生物活性物质，并释放入血液循环中，随血液通过血脑屏障进入中枢神经系统，影响运动神经元的功能。目前，发现肠道菌群产生的可能对ALS有影响的生物化合物主要有以下几种。
2.3.1短链脂肪酸（shortchainfattyacids，SCFAs）
SCFAs主要由结肠内的细菌通过对不可消化糖进行发酵作用而产生，主要包括乙酸、丙酸和丁酸，等。SCFAs在MGB中发挥重要调节作用，不仅可以通过免疫机制调节中性粒细胞、树突状细胞、巨噬细胞、单核细胞及T细胞的分化、募集和激活，又能抑制单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞的成熟，改变它们捕获抗原和产生IL-12、TNF等促炎细胞因子的能力。此外，动物模型研究表明，与正常小鼠比较，从未接触过活菌的无菌小鼠模型的血脑屏障通透性有所增加，而丁酸盐处理可使其血脑屏障通透性降至与普通成年小鼠相似的水平；丙酸盐也具有同样的作用。Zhang等发现8-9周龄的SOD1G93A转基因小鼠，在临床症状出现前就已存在肠道菌群失调（包括溶纤维丁酸菌等丁酸盐生成菌含量减少），丁酸辅酶A表达水平降低和肠壁通透性增加，而且能分泌抗菌分子并维持肠道屏障的潘氏细胞数量和功能也存在异常。予以含2%丁酸盐的饮用水处理2个月后，取小鼠结肠组织进行分析，结果发现丁酸盐促进了正常肠道菌群和肠壁紧密连接的恢复，降低了异常潘氏细胞数目以及SOD1蛋白在肠上皮细胞中的聚集，从而延缓小鼠的病程进展（小鼠体重下降和死亡时间均推迟）。由此可见，增加丁酸盐或其他SCFAs水平有可能逆转ALS的病理生理变化，有望成为ALS治疗的新方法。
2.3.2烟酰胺（nicotinamide，NAM）
NAM是维生素B3（烟酸）的酰胺形式，是细胞能量代谢途径的中间产物，已有研究证实，NAM与神经细胞的发育、存活及中枢神经系统的正常功能密切相关。Blacherl等（）对抗生素预先喂养的SOD1G93A小鼠口服嗜黏蛋白阿克曼菌，发现小鼠血液及大脑中的NAM水平显著增加，而且发现系统性持续注入NAM可改善小鼠的运动症状，并能改变小鼠31种脊髓基因的表达。进一步对相应基因进行表达分析，发现其表达产物大多与维持小鼠线粒体结构和功能的稳定以及清除超氧化物有关。同时，该团队进一步探究了人体内ALS与NAM的关联性，ALS患者肠道菌群中参与色氨酸及NAM代谢的基因表达减少，且血液和脑脊液NAM水平也降低，与上述研究结果一致。该研究表明，嗜黏蛋白阿克曼菌及NAM很可能对延缓ALS进程具有潜在的治疗作用。
2.3.3内*素
内*素是革兰阴性细菌外膜的主要成分，主要由脂多糖、蛋白质和磷脂组成的高分子复合物，当细菌被破坏时，释放出可溶内*素。研究发现健康人的血浆内*素水平约为10pg·mL-1，而ALS患者的血浆内*素水平约为40pg·mL-1。ALS患者血浆内*素水平升高，可能是肠道炎症和肠道菌群改变的结果。异常的TARDNA结合蛋白43（TDP-43）在神经元胞质内聚集已经被证实是ALS的病理特点之一。有研究表明，在小胶质细胞或星形胶质细胞培养液中添加脂多糖可导致TDP-43错误定位于胞质并聚集，并且向hTDP43ATALS转基因小鼠模型腹腔内长期注射脂多糖会加剧TDP-43在胞内聚集。此外，大剂量内*素可导致血脑屏障通透性增加，使血浆成分甚至内*素等进入大脑，加重神经炎症和退行性改变。由此可见，内*素水平升高促进TDP-43错误定位及聚集，破坏血脑屏障通透性，从而促进ALS的发生和进展。
03
ALS潜在治疗方向
目前，ALS的治疗手段非常匮乏，主要是营养及辅助呼吸等对症支持、药物延缓进展的疾病修饰治疗，临床亟待新的治疗方法问世。结合上述文献研究报道，可以从几个思路着手尝试开发新的治疗手段：①菌群移植或其他补充益生菌治疗；②调节机体免疫，减缓机体炎症；③补充丁酸盐等短链脂肪酸；④提高肠道嗜黏蛋白阿克曼菌比率以及脑脊液NAM水平；⑤促进肠壁紧密连接恢复其完整性；⑥降低血中内*素水平及其对血脑屏障的负性作用。已有研究初步证实菌群移植能够延缓ALS小鼠模型的运动症状进展，补充NAM也能一定程度改善ALS小鼠症状。但是目前的相关研究非常有限，主要集中于动物模型，因此有必要进行大量的基于ALS患者的临床研究证实相关治疗的有效性。
04
结语
目前，尽管多个动物实验研究及临床小样本研究结果都提示ALS患者存在相对独特的肠道细菌谱，而且表明肠道菌群与中枢神经系统之间存在着直接或间接的联系，但尚需更直接的研究证据阐明肠道菌群是如何影响ALS的发生和发展，阐明其因果关系，进而寻找有效的治疗手段。因此，未来需要更多、更深入的基础及临床研究解释肠道菌群对ALS作用机制，并给ALS患者带来新的治疗靶点和手段。
中国临床神经科学年6月第29卷第3期
作者：粟伟明商慧芳陈永平（医院神经内科）
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