以及以严谨的学术逻辑思维探索神经科学之奥秘
撰文、编译︱王思珍责编︱王思珍
神经肌肉疾病（neuromusculardiseases）是一类常见疾病的统称，包括肌营养不良症、神经源性疾病、炎症性疾病、先天性疾病、中*性疾病、代谢性疾病、以及内分泌性疾病等等。这些神经肌肉疾病可以直接影响骨骼肌，也可以直接影响运动神经元、周围神经、以及神经肌肉连接。
对于这类疾病的治疗而言，由于我们人体的骨骼肌数量多且复杂，以及由于目前所发现的致病基因片段太大，因此以腺病*介导的基因治疗还存在一些局限性。新的RNA疗法正常发展中，也有了一些初步治疗成效。
反义寡核苷酸（简称AONs）是一种短的、合成型的单链DNA类似物。AONs可以调节基因的剪接（位点）或失活，从而实现对RNA的操作，将突变了的转录本重新恢复到正常的转录本，从而纠正基因，阻止RNA*性、或生成正常功能的蛋白质产物，进而缓解或阻止疾病病理过程，达到治疗效果。但是RNA疗法也存在一些问题，比如安全性、有效性、组织靶向等。
年1月1日，意大利费拉拉大学和英国伦敦大学学院的lessandraFerlini、法国巴黎-萨克雷大学的AurelieGoyenvalle、以及伦敦大学学院的FrancescoMuntoni，在Science上撰写了题目为“RNA-targeteddrugsforneuromusculardiseases”的医学观点文章。作者分析了反义寡核苷酸RNA疗法在神经肌肉疾病的进展、现状和挑战。肌营养不良蛋白（dystrophin），又称肌萎缩蛋白，是一种连接肌动蛋白细胞骨架和细胞外基质的支架蛋白，在维持肌肉细胞膜完整性和避免肌肉变性方面起着关键作用。杜氏肌营养不良是一种神经肌肉疾病，也是一种X染色体连锁的遗传疾病，主要特征是进行性肌肉无力和变性，每名存活下来的男婴中就有1例。该疾病是由肌萎缩蛋白基因突变所引起的，该突变基因破坏了正常基因的开放阅读框，从而阻止了蛋白质的产生。使用AONs可以调节肌萎缩蛋白基因前体信使RNA的剪接位点（包括发生外显子跳跃），恢复正常的开放阅读框，产生全长型且有正常功能的肌萎缩蛋白，或产生截断型且有部分正常功能的肌萎缩蛋白，从而治疗或改善营养不良症，甚至是神经肌肉疾病（示图上左、上右）。
AONs往往带有多种化学修饰，避免了核酸酶对其的降解，也增加了其稳定性、以及与目的RNA的亲和力。带电的2′-O-甲基硫代磷酸（简称2′OMe）和不带电的磷酸二胺类吗啉代低聚物（简称PMO）是两种常见的AONs化学修饰方法。带电2′OMe修饰的AONs并没有明显的治疗效果，也不能明显清除肌萎缩蛋白以及其他*性；相比之下，不带电PMO修饰的AONs能够显著降低肌萎缩蛋白的表达，患者治疗也有初步的治疗效果，但这种治疗也饱受争议，比如是否有潜在的风险或副作用，肌萎缩蛋白作为这类疾病的关键生物标志物是否恰当，等等。
实际上，带有这类修饰的AONs成功靶向肌肉的效率很低，进而成功靶向前体信使RNA的效率也就很低。肌肉对PMOs的摄取依赖于与营养不良病变相关的炎症灶，也依赖于含有PMOs的单核细胞和成肌细胞与受损肌纤维的融合。因此必须提高AONs传递的效率。三环-DNA是一种疏水性化学修饰方法，经三环-DNA修饰的AONs可以很好地靶向营养不良症的肌肉，也能穿过血脑屏障，还能缓解一些并发症，如恐惧焦虑等。此外，细胞穿膜肽是一种短的阳离子多肽或两性多肽，能够帮助AONs顺利穿过细胞膜，并避免AONs被核内体所吞噬（核内体是一种膜结合器，属于囊泡结构，可以发挥细胞内吞作用）。示图：神经肌肉疾病中的四种反义寡核苷酸疗法：外显子跳跃、外显子剪接并入、RNA*性抑制、基因沉默
（图片引自：AlessandraFerlini,AurelieGoyenvalle,FrancescoMuntoni,Science,;:29-31）
脊髓性肌萎缩症（简称SMA）是一种常见的遗传性神经肌肉病，为常染色体隐性遗传，以进行性、对称性肢体近端和躯干肌肉无力、萎缩为主要临床表现，患者最终死于呼吸衰竭和严重的肺部感染，是一种致死性疾病，SMA婴儿永远无法坐着，且通常在2岁前死亡，目前尚无有效的治疗方法。存活运动神经元蛋白（简称SMN）是一种广泛存在的参与转录调控和细胞内转运的蛋白，其缺失可导致选择性运动神经元死亡。SMN蛋白1基因（SMN1）的失活突变可导致SMA。在灵长类中，有一个比较特殊的SMN蛋白的基因变异，简称SMN2，该基因的7号外显子的剪接增强子能力相对微弱，致使该外显子被正常剪接到前体信使RNA的几率大大降低，从而可导致SMN蛋白表达量的减少（示图上右）。
诺西那生钠注射液Spinraza，又称nusinersen，是一个针对SMN2基因的AON，也是首个被批准的SMA治疗药物，适用为在儿童和成年患者。此款AONs药物可以调节SMN2的剪接，使剪接位点跳过7号外显子，这样前体信使RNA中包含了7号外显子，进而产生全长且有正常功能的SMN蛋白，从而达到疾病治疗效果。然而Nusinersen并不能穿过血脑屏障，需要直接鞘内注射，进入脑脊液（示图上右）。AONs也可以通过激活核糖核酸酶H（RNaseH）而使mRNA沉默或水平下调，RNaseH识别RNA-DNA杂交链，然后进行RNA降解；这种RNA降解可以是单等位基因特异的（即靶向突变型转录本），也可以是双等位基因的（即靶向突野生型转录本）。强直性肌营养不良（简称DM）是一种以进行性肌无力、肌萎缩和肌强直为主要特点的神经肌肉疾病，为常染色体显性遗传。I型DM（DM1）比较常见，由DM1蛋白激酶基因中的CUG重复扩增所引起，该重复序列形成有*的RNA发夹结构，在细胞核内积累并诱导下游*性作用。嵌合体AONs，又称Gapmers，激活RNaseH活性，进而降解含有CUG重复序列的mRNA，从而减少*性转录本的数量（示图下左）。
肌萎缩性侧索硬化症（ALS），又称运动神经元病，俗称渐冻人症，是一种累及上行运动神经元（大脑，脑干、脊髓），又影响到下行运动神经元（颅神经核，脊髓前角细胞）及其支配的躯干、四肢和头面部肌肉的慢性进行性变性疾病。C9ORF72基因的显性突变占家族性ALS病例的50%。人类神经细胞和ALS小鼠脑室内，AONs能够致使含有扩增重复序列的C9ORF72的mRNA发生沉默（示图下右）。
超氧化物歧化酶1（简称SOD1）基因突变也会引起ALS。通过鞘内注射给药，AONs靶向SOD1的显性错义体，发生双等位基因沉默，从而降低运动神经元中由该错义突变引起的氧化应激*性作用，治疗SOD1相关的ALS。中央核性肌病（简称CMN），也称肌管性肌病，是一种显性遗传的神经肌肉疾病，病理特征包括肌细胞中央核比例增高、肌肉萎缩、以及T-小管变形等。发动蛋白2（DNM2）基因突变引起这些病理变化。DNM2是一种被广泛表达的鸟苷三磷酸酶（GTPase）机械敏感酶，参与胞吞、胞外、膜重塑和细胞骨架组织。在小鼠中，AONs均能靶向突变型和野生型DNM2的RNA，发生基因沉默，减少蛋白表达，改善CMN病理，为CMN的AONs临床治疗依据。最后，总结一下，RNA疗法已经取得了令人鼓舞的进展，一些药物和产品正在研发中。当然临床失败经历也告诉我们，开发AONs的化学修饰剂、共轭物（或偶联物）、完善给药体系、提高药物靶向肌肉的效率、理解药物摄取动力学及药物细胞内的动力学，是势在必行的。此外，通过患者鞘内注射AONs药物，再使药物顺利进入大脑，发挥治疗效果，然而这对于患者而言，无疑增加了一些额外负担，比如潜在的治疗风险和副作用，因此，在未来，我们需要开发出能够主动通过血脑屏障的且安全的AONs药物。单倍剂量不足（haploinsufficiency）指一个等位基因突变后，另一个等位基因能正常表达，但这只有正常水平50%的蛋白质，不足以维持细胞正常的生理功能，在AONs介导的基因沉默方法中，双等位基因策略可能会产生与单倍剂量不足相关的影响以及安全性等问题。
总的来说，在这些新一代AONs化合物的研究中，必须综合考虑这些严峻条件，充分阐明AONs药物的临床价值（即临床好处）、以及药物对疾病表型的治疗程度。
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